Mello Biotechnology
 
작성일 : 13-02-05
[Mello Biotechnology] Somatic Cell Reprogramming using microRNA
mirPS 세포유도(iPS 세포유도) Kit / mirPS Cells
 
Somatic Cell Reprogramming using microRNA
mirPS 세포유도(iPS 세포유도) Kit / mirPS Cells
 
 
Mir-302 Electroporation & Liposomal Kit
 
The mir-302 electroporation expression kit or liposomal express kit are used for intracellular delivery and expression of the
mir-302 microRNA family (mir-302a, b, c and d pre-microRNA cluster).  A novel electroporation delivery scheme is used to
integrate a cytomegalovirus (CMV) or Tet-regulated CMV (TRE-CMV) promoter-driven SpRNAi-RGFP transgene into the
cells of interest for intracellular expression of the mir-302 microRNA family (mir-302s). Mir-302 family is placed in the intron
of the SpRNAi-RGFP transgene and generated as a part of the transgene transcript RNA (pre-mRNA), containing two
RGFP protein-coding exons and one non-coding intron. The intron is then spliced out of the pre-mRNA and further
excised into small mir-302 microRNAs capable of triggering targeted gene silencing. At the same time, the RGFP exons
are ligated together to form a mature mRNA for synthesis of a red fluorescent marker protein. The presence of RGFP
serves as an indicator for mir-302 family expression and processing. The delivery efficiency depends on the cell type,
delivery method, & culture conditions.  
 
 
Mir-302 and mirPS® Cells
 
The Mir-302 family is expressed most abundantly in slow-growing human embryonic stem (hES) cells and quickly
decreases after cells differentiate and proliferate. Transgenic delivery of mir-302s into human skin, hair follicle and
melanoma cells has been shown to reprogram these somatic cell to reprogrammed pluripotent stem (iPS)-like cells1. The
mir-302-reprogrammed pluripotent stem cells, namely mirPS cells, not only express many key hES cell markers, such as
Oct4 and Sox2, but also have a highly demethylated genome similar to a reprogrammed zygotic genome. Microarray
analyses have revealed that genome-wide gene expression patterns between the mirPS and hES H1 and H9 cells share
over 86%–92% similarity. Under molecular guidance in vitro, these mirPS cells can differentiate into many distinct tissue
cell types. Therefore, mir-302s may be used in place of Oct4, Sox2 and Nanog for more simple and efficient generation
of iPS cell lines.
 
 
High Success Rate
  • 2%~10% efficiency depending on delivery method & cell types
  • Only one factor required to reprogram
  • GFP reporter: easily identify transfected cells
  • Puromycin selection
 
Tumor-Free
  • Suppresses CDK2 and CDK4/6 cell cycle pathways
  • Even reprograms cancer cells into iPS
  • No genomic integration
  • High clinical potential
 
Proven Stemness
  • Expression of Major Stem Cell Markers :
  • Oct4, Sox2, Nanog, miR-302
  • Self Renewal: 26 passages in feeder-free conditions
  • Embryoid body formation
  • Pluripotent differentiation into teratoma-like tissues
 
 
다른 기술과의 비교
 
mirPS Cells
4 Factor iPS
hESC
Reprogramming 인자
 mir-302/367
OSKM (Oct4, Sox2, K1f4, c-Myc)
OSNL (Oct4, Sox2, Nanog, Lin28)
n/a
Source
체세포
체세포
배아세포
Immuno-compatibility
high
high
low
Reprogramming Yield
2 ~ 10 %
0.02 ~ 0.2 %
n/a
Delivery method
Electroporation,
Liposomal, Lentiviral
Viral, PiggyBac
Episomal, mRNA/Protein
n/a
Tumorigenicity
Tumor-Free
Tumor-Prone
Tumor-Prone
세포주기
slow  
high
slow (morula) /
fast(배반포)
도입 유전자
하나의 microRNA
3 ~ 4 개의 유전자 세트
n/a
Feeder 세포
불필요
필요
필요
 
 
 
microRNA Electroporation Transfection Kits
 
특징
  • Construct는 GFP 유전자와 puromycin 내성 유전자를 포함, CMV 프로모터를 사용하고 있습니다.
  • Electroporation으로 쉽게 벡터를 세포 내에 도입 할 수 있습니다.
  • 높은 성공률(Electroporation을 한 세포 수에 대해 2 ~ 10 %의 수율)에서 mirPS 세포(iPS 세포)를 제작할 수 있습니다.
  • 피더 세포는 필요하지 않습니다.
  • 인간의 배아세포 · 난세포 · 종양세포를 사용하지 않고, 또한 게놈 배열에 변화를 일으키지 않기 때문에 안전합니다.
  • 제작한 mirPS 세포는 multipotent로 입증되어 있으며, 높은 면역 호환성을 가지고 있습니다.
 
mirPS® 세포와 hES 세포와의 유사성
 
Similarity of global gene expression patterns between human ES H1/H9 and mirPShHFC cells, determined by microarray
analyses.
 
 
인간 모낭세포에서 유래한 mirPS 세포의 embryoid body의 형성
 
인간 모낭세포에서 유래하는 mirPS 세포의 embryoid body 형성의 모습입니다. Embryoid body는 ES 세포 등이 분화를 하면서 집합하여 세포 덩어리가 되어, 각 기관으로 기능하기 시작 프로세스 중에 나타납니다. 다능성 줄기세포의 분화를 유도할 때에, 배엽체의 형성이 중요합니다. mirPS 세포에서도 이 같은 배엽체의 형성이 관찰됩니다.
 
 
키트로 사용할 수 있는 세포는 포유류의 세포(마우스 제외)에 사용할 수 있습니다. 인간의 다음 세포에서 이 키트를 이용한 벡터 도입이 가능한 것으로 확인되고 있습니다.
  • 피부 / 모낭 멜라닌 형성 세포
  • Keratin 생성 세포
  • Fibroblast
  • 배성 신장상피 HEK 세포
 
   Expression of mir-302 in microRNA array analysis
   mir-302 with inducible Tet-On/Dox mirPS plasmid
 
 
Similar ES markers expressed in human ES H1/H9 and mirPS-hHFC cells
 
     WA01-H1 : hPS 세포 WA01-H1 주
     WA09-H9 : hPS 세포 WA09-H9 주
     mirPS-colo : 흑색종 세포 유래 mirPS 세포
     Colo control : 흑색종 세포
 
     Oct3 / 4, SSEA3, SSEA4, Sox2, Nanog, Klf4는 다능성 줄기세포에 특유한 유전자
 
 
mir-302 및 mir-302/367의 차이
 
microRNA 인 mir-302는 iPS 세포를 제작하는 데 필요한 클러스터 배열인 것으로 알려져 있습니다만, iPS 세포를 유도하는 클러스터 배열은 그 밖에도 몇 가지, 그 클러스터 배열과 mir-302를 동시에 도입하는 것으로, mir-302만을 도입한 경우에 비해,
iPS 세포로의 유도 효율을 높일 수 있습니다. Mello biotechnology 사에서는 mir-302 외에, mir-367 클러스터를 사용하여 유도 효율을 높이고 있습니다.
도입하는 세포의 종류에 따라 다르지만, "mirPS® mir-302/367 Electroporation Kit"는 "mirPS® mir-302 Electroporation
Kit"에 비해 약 4배 정도 iPS 세포로의 유도 효율이 높은 제품입니다 .
 
 
microRNA Liposomal Transfection Kits
 
mir-302 또는 mir-302/367을 lipofection으로 체세포에 도입 · 발현시켜 체세포를 다능성 줄기세포 reprogramming "mirPS®
mir-302 Liposomal Kit", "mirPS® mir-302/367 Liposomal Kit"는 체세포를 다능성 줄기세포로 reprogramming 하는 것을 목적으로, mir-302 family 또는 mir-302 family + mir-367을 liposomal transfection으로 체세포에 도입·발현시키는 키트입니다.
Lipofection으로 microRNA를 도입하기 위해 electroporation 법에서 같은 전용장비를 준비 할 필요가 없고, 또한 iPS 세포처럼
retrovirus를 세포에 사용할 필요가 없기 때문에 안전하고 빠르고 쉽게 microRNA를 세포 내에 도입 할 수 있습니다. 또한
Electroporation Kit(Mello Biotechnology) 마찬가지로, 일반적인 iPS 세포의 수율이 약 0.02 ~ 0.2 % 정도 인 반면, mirPS® 세포는 lipofection을 이용한 세포 수에 (대하여) 약 2 ~ 10 %의 높은 수율을 가지고 있습니다.
 
miR-302/367 Vector Map과 Microarray of miR-302 (벡터는 Electroporation kit에 포함된 벡터와 같은 배열입니다)
 
 
Accessories
 
mirPS® Cell Line h01
HEK (인간배아신장) 유래의 mirPS 세포주입니다. Mello Biotechnology사에서 이미 개연성으로 판매를 하고 있는 세포주입니다. 본 제품에는 "mirPS® Cell Line h01 Culture Medium(250 ml)"도 포함되어 있습니다. Medium 만 추가로 구입하실 수 있습니다.
 
mirPS Feeder-Free Culture Medium
mirPS 세포를 배양하는데 최적화된 배지입니다.
 
배지구성 (250mL / 개)
  • 가열 불활성화한 소태아혈청(FBS/Fetal Bovine Serum)
  • Non-essential amino acid
  • 항생물질
  • β-mercaptoethanol
  • Sodium pyruvate
  • Glutamax supplement
  • FGF(Fibroblast Growth Factor)
 
 
 
References ;
  • SL Lin, et al., (2011) “Regulation of somatic cell reprogramming through inducible mir-302 expression.”, Nucleic Acids Research, Volume 39, Issue 3.
  • F. Anokye-Danso, et al., (2011) "Highly Efficient miRNA-Mediated Reprogramming of Mouse and Human Somatic Cells to Pluripotency“, Cell Stem Cell, Volume 8, Issue 4.
  • D Subramanyam, et al., (2011) “Multiple targets of miR-302 and miR-372 promote reprogramming of human fibroblasts to induced pluripotent stem cells”, Nature Biotechnology, Letter.
  • SL Lin, et al., (2010) “MicroRNA miR-302 inhibits the tumorigenecity of human pluripotent stem cells by coordinate suppression of the CDK2 and CDK4/6 cell cycle pathways.”, Cancer Research, Volume 70 Issue 20.
  • Card, et al., (2008) "Oct4/Sox2-Regulated miR-302 Targets Cyclin D1 in Human Embryonic Stem Cells", Mol Cell Biol. Volume 28, Issue 20.
 
 
Ordering informations ;
 
microRNA Electroporation Transfection Kits
Catalog Number
Product Name
Size
M-105-302-CM
mirPS® mir-302 Electroporation Kit
5 runs
M-106-302-CM
mirPS® mir-302 Electroporation Kit
10 runs
M-107-302-CM
mirPS® mir-302/367 Electroporation Kit
5 runs
M-108-302-CM
mirPS® mir-302/367 Electroporation Kit
10 runs
 
microRNA Liposomal/Polysomal Transfection Kits
Catalog Number
Product Name
Size
M-125-302-CM
mirPS® mir-302 Liposomal/Polysomal Kit
5 runs
M-126-302-CM
mirPS® mir-302 Liposomal/Polysomal Kit
10 runs
M-127-302-CM
mirPS® mir-302/367 Liposomal/Polysomal Kit
5 runs
M-128-302-CM
mirPS® mir-302/367 Liposomal/Polysomal Kit
10 runs
 
Accessories
Catalog Number
Product Name
Size
M-200-101
mirPS® Cell Line h01 (HEK-293)
vial
M-800-011
mirPS® Feeder-Free Culture Medium
250ml
M-820-210
Hypoosmolar Buffer Solution
5ml
M-820-220
Isoosmolar Buffer Solution
5ml
 
 
 
▣ 관련 페이지 ; Natural miRNA Precursor