Wako Pure Chemical
 
작성일 : 15-03-18
[Wako Pure Chemical] 미분화 인간 ES 세포 · 인간 iPS 세포 검출 시약
형광표지 rBC2LCN (AiLecS1)

 

미분화 인간 ES 세포 · 인간 iPS 세포 검출 시약

형광표지 rBC2LCN (AiLecS1)

 

 

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rBC2LCN (AiLecS1)는 Burkholderia cenocepacia 유래의 lectin인 BC2L-C의 N 말단 도메인을 대장균에서 발현

시킨 recombinant lectin 입니다. rBC2LCN는 미분화 인간 ES 세포 · 인간 iPS 세포의 세포 표면에 존재하는 당쇄를

인식합니다.

본 제품은 형광표지 되어 인간 ES 세포 · 인간 iPS 세포의 배양액에 첨가하여 미분화 세포를 live 상태로 해석 할 수

있기 때문에 미분화 세포 검출용 마커로 유용합니다. 세포염색, flowcytometry의 어느 것에도 사용 할 수 있습니다.

또한 본 제품의 공존 하에서 수 일간 배양을 계속하여도 세포 독성이 확인되어 있지 않습니다.

 

 

특징

  • 배지에 첨가하는 것 만으로 염색 가능
  • 세포 고정하지 않고 세포를 산 채로 명료하게 염색 가능
  • 세포 독성이 낮고 염색한 상태에서 배양 가능
  • Tra-1-60, Tra-1-81, SSEA-3, SSEA-4와 마찬가지로 세포 표면의 당쇄 인식
  • 세포 염색, flowcytometry에 사용 가능

 

 

* 사용방법

 

[세포 염색]

 

■ 살아있는 세포 염색 (Live Cell Imaging)

1. 배양중인 인간 ES 세포 · 인간 iPS 세포를 준비한다.

2. 배지 1ml 당 형광 표지 rBC2LCN을 1 ~ 10μl 첨가한다.

3. 37 ℃, 5 % CO 2 에서 30 분 동안 incubation.

4. 새로운 배지 또는 HBSS (+)로 교환한다.

5. 형광 현미경을 이용하여 관찰한다.

 

■ 고정 세포의 염색

1. 배양중인 인간 ES 세포 · 인간 iPS 세포를 준비한다.

2. 배지를 제거하고 D-PBS (+)로 세척한다.

3. 4 % paraformaldehyde 용액 (PFA)를 첨가하여 실온에서 10 ~ 20 분간 방치한다.

4. PFA를 제거 후 D-PBS (-)로 3 회 세척한다.

5. D-PBS (-)를 첨가한다.

6. D-PBS (-) 1ml 당 형광 표지 rBC2LCN을 1 ~ 10μl 첨가한다.

7. 37 ℃, 5 % CO 2 에서 30 분 동안 incubation.

8. D-PBS (-)로 교환한다.

9. 형광 현미경을 이용하여 관찰한다.

 

[유동 세포 계측법]

1. 배양중인 인간 ES 세포 · 인간 iPS 세포를 준비한다.

2. 세포 분산 용액을 사용하여 single cell에 분산한다.

3. 세포 분산 용액을 튜브에 옮기고, 1,000rpm에서 3 분간 원심한다.

4. 상청액을 제거 후 FCM Buffer로 세포를 현탁하여 원심 후 상청액을 버린다.

   * FCM Buffer : D-PBS (-)와 HBSS (-) 혹은 그들에게 10mmol / l EDTA, 1 % BSA를 포함하는 것

5. 5 × 10 6 cells / ml가 되도록 FCM Buffer로 현탁한다.

6. 세포 현탁액 1ml 당 형광 표지 rBC2LCN을 1 ~ 10μl 첨가한다.

7. 차광하여 실온에서 30 분간 방치한다.

8. 1,000rpm에서 3 분간 원심 분리하여 상청액을 버린다.

9. FCM Buffer로 세포를 현탁하여 원심 후 상청액을 버린다.

10. 적당량의 FCM Buffer에서 다시 현탁한다.

11. Flowcytometry로 처리.

  

- 사용상 주의

1. rBC2LCN 의한 염색은 2,3 일간은 유지됩니다.

2. 혈청을 포함하는 배지를 사용하는 경우, signal의 back ground가 높아질 가능성이 있습니다.

3. Flowcytometry에 의해 세포분류를 할 경우 세포 분산 때 및 FCM Buffer에 최종 농도 10μmol / l이 되도록 Y-

   27632을 첨가하십시오.

 

 

인간 iPS 세포의 살아있는 세포 염색 (Live Cell Imaging)


 rBC2LCN-FITC 및 rBC2LCN-635, Hoechst33342을 사용하여 인간 iPS 세포 201B7주를 염색했다 (세포 고정 없음)

 

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                                (희석 배율 1 : 1,000)

 

 

 rBC2LCN-FITC, Tra-1-60, Tra-1-81을 이용하여 인간 iPS 세포 201B7 주를 염색했다 (세포 고정 없음).

 

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rBC2LCN은 Tra-1-60, Tra-1-81과 비교하여 살아있는 세포 염색 강도가 강하다. Tra-1-60, Tra-1-81는 염색이

약하면서도 quenching 하는 것이 빠르다. rBC2LCN은 배지 교환 후에도 2 일째까지 선명하게 염색이 지속된다.

 

 

인간 iPS 세포 고정 후 염색


인간 iPS 세포 201B7 주를 paraformaldehyde 로 고정 후 rBC2LCN와 DAPI를 이용하여 세포 염색했다.

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인간 iPS 세포에 대한 세포 독성 평가


인간 iPS 세포 201B7 주 배양액에 배양액의 1 / 1,000,1 / 100,1 / 50 분량의 rBC2LCN-FITC를 첨가 한 상태에서

배양을 계속했다. 그 결과 어느 농도에서도 rBC2LCN-FITC의 농도에 관계없이 같은 정도의 세포 증식을 나타내는

것을 확인했다.

 

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[세포주]

인간 iPS 세포 201B7 주

 

[배지 조성]

StemSure ® hPSC 매체 Δ + 35ng / ml bFGF

 

[코팅]

Matrigel ® hESC-Qualified Matrix

 

[세포 파종 수]

4 × 10 4 cells / well (12 웰 플레이트를 사용)

 

 

Flow Cytometry를 이용한 인간 iPS 세포의 분리


rBC2LCN-FITC 및 rBC2LCN-635을 사용하여 인간 iPS 세포 201B7 주와 사람 정상 diploid fibroblast를 염색하고

flowcytometry 하였다.  결과로, 미분화의 인간 iPS 세포와 분화한 인간 diploid fibroblast를 분리 할 수 있었다.

 

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참고 문헌

1. Onuma, Y., et al .: Biochem. Biophys. Res. Commun ., 431 , 524 (2013).

2. Tateno, H., et al . : Stem Cells Transl. Med ., 2 , 265 (2013).

3. Tateno, H., et al . : Sci. Rep ., 4 , 4069 (2014).

 

 

Brochure (PDF)  

 

 

Ordering informations

   

Catalog No.

Product Name

Size

180-02991 (PDF)

rBC2LCN-FITC (AiLecS1-FITC), 세포염색용

100 μl

186-02993 (PDF)

100 μl x 5

185-03161 (PDF)

rBC2LCN-635 (AiLecS1-635), 세포염색용

100 μl

181-03163 (PDF)

100 μl x 5

029-18061

BC2LCN (AiLecS1) Lectin, recombinant, Solution, (당쇄연구용)

1 mg

 

 

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